June Gorrochategui, Melanie Parejo, Andone Estonba (Applied Genomics and Bioinformatics taldeko ikertzaileak, EHU), Egoitz Galartza (ERBEL)
Proteger la diversidad de las abejas melíferas
Las abejas melíferas (Apis mellifera) muestran una considerable variación en su área de biogeográfica y están compuestas por al menos 30 subespecies pertenecientes a diferentes linajes evolutivos. Europa alberga gran parte de esta diversidad con numerosas subespecies endémicas representativas de cuatro de estos linajes evolutivos, concretamente del linaje africano (A), el linaje de Europa Central y Oriental (C), el linaje de Europa Occidental y Septentrional (M) y el linaje de Oriente Próximo y Asia Central (O). Sin embargo, la actividad humana ha reducido paulativamente tanto la diversidad genética como el territorio natural de algunas de las abejas melíferas europeas. Uno de los temores que suscita el comercio e importación de reinas a gran escala, así como la transhumancia de larga distancia, es que se reduzcan o pierdan las poblaciones de abejas melíferas autóctonas adaptadas al entorno, debido a la sustitución por abejas no autóctonas o simplemente por hibridación. Se ha demostrado que las abejas melíferas adaptadas al entorno local tienen una mayor capacidad de supervivencia, por lo que la promoción de la cría de abejas locales constituye un paso importante hacia la sostenibilidad de la abeja a largo plazo.
En toda Europa se han puesto en marcha numerosos proyectos para la conservación y cría de abejas melíferas autóctonas, entre los que se incluyen los programas de mejora genética. Su éxito depende del apareamiento controlado y del seguimiento ininterrumpido de la ascendencia genética de la población. Para ello es necesario una herramienta de análisis genético rápida, precisa y fácil de usar.
El proyecto SmartBees se inició con el propósito de desarrollar nuevas herramientas para criar y conservar la diversidad de las abejas melíferas en Europa. Basándonos en un muestreo exhaustivo de la diversidad genética de dichas abejas hemos diseñado una herramienta molecular compuesta por marcadores genéticos de un solo nucleótido (SNP) altamente informativos, la cual permite determinar la subespecie de origen a cualquier abeja europea analizada.
Procedimiento
Se han muestreado un total de 22 poblaciones, las cuales representan los cuatro linajes evolutivos europeos, así como 14 subespecies distribuidas nativamente por toda Europa y por sus regiones adyacentes (Figura 1). Cada población seleccionada incluía alrededor de 100 abejas obreras de colonias no relacionadas, sumando más de 2.000 muestras finales, y constituyendo el muestreo más completo de abejas melíferas europeas realizado hasta la fecha.
Basándonos en los datos de dicha secuenciación, seleccionamos los marcadores genéticos más informativos para la ascendencia. Es decir, los marcadores genéticos que mejor discriminan las 14 subespecies de abejas melíferas europeas. En total, son más de 4.000 polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). A continuación, genotipamos individualmente las 100 muestras de cada población, con un total de >2000 abejas. Estos datos de genotipado se visualizaron empleando un diagrama denominado t-SNE, el cual trata de agrupar las muestras de la manera más compacta posible en un mapa bidimensional en el que cada individuo está representado por un símbolo diferente (Figura 2). Las muestras se agrupan según su linaje evolutivo o subespecie en grupos aislados (nubes de puntos). La única subespecie del linaje A de nuestro estudio, A. m. ruttneri, se sitúa en el centro, intermedio a los otros conjuntos. En el linaje O, las abejas A. m. cypria aparecen totalmente separadas de A. m. anatoliaca, A. m. caucasia y A. m. remipes, las cuales están menos diferenciadas. Las dos subespecies del linaje M están bien diferenciadas, con las poblaciones de A. m. mellifera agrupadas en tres subconjuntos que representan regiones de muestreo distantes (región de Burzyan, Rusia, subgrupo superior de A. m. mellifera en la Figura 2) o aisladas (isla de Læsø, Dinamarca, inferior subgrupo de A. m. mellifera). Las muestras de linaje C se agrupan en tres subgrupos: (i) A. m. ligustica, (ii) abejas A. m. carnica que incluyen parte de las muestras de A. m. carpatica y (iii) un subgrupo heterogéneo de A. m. macedonica, A. m. cecropia, A. m. adami, A. m. rodopica y el resto de abejas A. m. carpatica.
Muestras de prueba adicionales y modelo de aprendizaje automático
Además, se genotipificaron otras 1.900 muestras de abejas obreras procedentes de diferentes apiarios de cría de SmartBees en toda Europa. Estas 1900 muestras, junto con las 2000 ya genotipadas (en total >3900 muestras) fueron empleadas para construir un modelo estadístico que clasifica las abejas melíferas europeas utilizando algoritmos de aprendizaje automático. Este modelo calcula la probabilidad de que una muestra concreta pertenezca a cualquiera de las 14 subespecies diferentes. La ventaja de utilizar un modelo de aprendizaje automático es que no se basa en ninguna hipótesis previa y, debido a lo cual, se pueden revelar diferencias sutiles. Esto era especialmente relevante para nuestro estudio, debido al elevado número de subespecies estrechamente relacionadas que queríamos discriminar. En nuestra publicación científica (Momeni et al. 2021) se pueden encontrar más detalles sobre los métodos específicos de clasificación.
Precisión en la asignación de subespecies
El modelo asignó correctamente la mayoría de las muestras con una precisión media del 96,2%. La mejor manera de visualizar dichos resultados es mediante una matriz de confusión, la cual indica los porcentajes de muestras predichas correcta o incorrectamente por el modelo (Figura 3). Las cifras de la diagonal central indican el porcentaje de muestras clasificadas correctamente, mientras que los triángulos superior e inferior indican las muestras mal clasificadas. Se considera una clasificaciones errónea cuando las muestras predichas por el modelo son una subespecie diferente a la etiquetada. Estos errores se deben al incorrecto etiquetado de las muestras de prueba o a una diferenciación limitada entre las poblaciones de referencia, causada por la proximidad geográfica o la interferencia humana.
Para la aplicación del modelo en programas de conservación y de cría, establecimos un umbral mínimo de 90%. Si el pronóstico para una muestra es inferior al umbral de 90% se considera «no asignada», mientras que si supera el límite se asigna a la subespecie correspondiente.
Retos de la diversidad y próximos pasos
La considerable diversidad de las abejas melíferas europeas supuso un reto a la hora de diseñar una herramienta de diagnóstico de subespecies. La gran divergencia entre linajes evolutivos permite su fácil distinción genética empleando unos pocos SNP. Sin embargo, la diferenciación de subespecies fue más difícil, ya que la divergencia entre subspecies del mismo linaje evolutivo ocurrió hace poco y, por lo tanto son genéticamente muy similares. Además, hay algunas zonas de Europa en las que la variación de las subespecies de A. mellifera aún no ha sido descrita exhaustivamente, mientras que en otras la introducción artifical de otras subspecies difumina los límites naturales entre las subespecies. Los programas nacionales de cría también han podido interrumpir el flujo natural de genes, alterando así el fondo genético de la subespecie original. Debido a esto, algunas subespecies fueron más fáciles de clasificar que otras y algunas muestras quedaron sin asignar con nuestra herramienta de diagnóstico. No obstante, es una herramienta dinámica modificable que permite perfeccionar la base de datos de referencia y/o incluir más subespecies. En este sentido, investigaciones en curso indican que este método es aplicable a A. m. siciliana de Sicilia.
Utilidad
Esta herramienta permite analizar nuevas muestras de abejas y determinar su origen genético. Su aplicación será muy valiosa ya que posibilitara que los apicultores determinen la subespecie de sus abejas y si han sido hibridadas; que los responsables de la conservación en Europa controlen las tasas de hibridación de las colonias situadas en conservatorios mediante el diagnóstico de subspecies, que los veterinarios controlen el comercio de reinas; que los criadores de abejas certifiquen la subespecie de sus reinas; y que los apicultores avalen sus productos apícolas.
Agradecimientos
Este trabajo sólo ha sido posible gracias a las valiosas muestras proporcionadas por numerosos apicultores, criadores de abejas y otros colaboradores, a los que damos nuestro más sincero agradecimiento. El proyecto SmartBees fue financiado por la Comisión Europea en el marco de su programa FP7 KBBE (2013.1.3-02, Grant nr. 613960). Melanie Parejo recibió una subvención del Gobierno Vasco (IT1233-19).
Para acceder a la publicación científica completa: https://bmcgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12864-021-07379-7